怎样上梅西美国官网:做PCR反应为什么在循环结束后要有5min延伸反应?
做PCR反应为什么在循环结束后要有5min延伸反应
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这个问题比较好理解,因为在循环结束后,体系中的taq酶可能很多正处于复制状态,如果此时降到室温,将会影响最终产率。所以再留出5分钟,以使正在复制中的taq酶能够复制完全,以合成更多的目的分子。
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看来可能我的表述不够清楚,那我稍微详细的说下
我们来看看最后一个循环
先95度,dna在高温下变性,解链成单链分子
然后退火,具体温度与所用引物有关,就以55度为例吧。
引物与单链dna模板结合上去
再72度延伸,在taq聚合酶的作用下,引物延伸。
该循环结束。
注意,此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加5分钟,以允许尚处于合成状态的dna分子能够完成整条链的合成。
在rna的逆转录时,也有这样的一个步骤。
用途也是一样的。
不知这下有没有讲清楚?
楼主指的延伸反应是退火后的,还是整体35次左右循环结束后的?
退火后的是让其分子链延伸,最后的我就不确定了,刚翻书翻了半天也没找到,似乎是待体系趋于温和、平静,否则容易伤害到刚合成好的DNA。
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PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:
70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
看vagabonder - 同进士出身 七级说的我就不理解了……
vagabonder说:因为在循环结束后,体系中的taq酶可能很多正处于复制状态,如果此时降到室温,将会影响最终产率。所以再留出5分钟,以使正在复制中的taq酶能够复制完全,以合成更多的目的分子。
如果说taq酶此时正处于复制状态,那延伸时间它在干什么?
更重要的是,如果说taq酶此时正处于复制状态,那循环内可是每次延伸时间完了之后就立刻升温到90度以上进行下一轮循环的变性,而90度以上DNA合成几乎是停止的,照vagabonder的说法,岂不是PCR整个过程30-40次循环都没产物,只有最后一次有产物?